中国报告大厅网讯，护肝片作为一款源自经典方剂化裁而来的药物，由柴胡、茵陈、五味子等多味药材组成，具有疏肝理气、健脾消食、降低转氨酶等功效，在脂肪肝、慢性肝炎、药物性肝损伤等疾病的治疗中有着确切作用。然而，当前其质量控制标准存在单一性，药效物质基础和作用机制也尚未完全明确，这在一定程度上限制了其临床疗效的进一步提升。因此，对护肝片关键质量标志物进行深入研究，对于提高其质量标准和临床应用价值具有重要意义。
《2025-2030年中国护肝片行业市场调查研究及投资前景分析报告》指出，护肝片的重要指标成分确定，遵循君臣佐使的配伍原则。君药柴胡在煎煮过程中，其含有的柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷 d 会发生转化，生成柴胡皂苷 b₂，且前期研究未检测到柴胡皂苷 a 和柴胡皂苷 d，故将柴胡皂苷 b₂作为重要指标成分;君药茵陈的指标成分为绿原酸，臣药板蓝根的指标成分为(R,S)- 告依春。臣药五味子中，五味子醇甲、五味子酯甲是规定的指标性成分，联苯环烯辛木脂素类成分为其特征性成分，五味子甲素作为该类成分的直接前体，其结构修饰产生的五味子醇甲、五味子醇乙和五味子丙素也被纳入重要指标成分。佐使药猪胆粉基于有效性原则选择甘氨猪去氧胆酸作为指标成分，而绿豆因未发现专属性成分未选入。综上，确定了护肝片的 9 种重要指标成分：柴胡皂苷 b₂、绿原酸、(R,S)- 告依春、五味子甲素、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子醇乙、五味子丙素、甘氨猪去氧胆酸。
为测定这 9 种成分的含量，建立了相应的方法。色谱条件为：采用 Themo Syncronis C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm 5μm)，流动相为 0.3% 磷酸水溶液(A)- 乙腈(B)，进行梯度洗脱，柱温 35℃，流速 1mL・min⁻¹，检测波长 200nm 和 250nm，进样量 10μL。对照品溶液制备时，取各对照品适量，精密称定后加甲醇配制成储备液，再配制成混合对照品溶液。供试品溶液制备方面，单味药参照相关标准方法，中间体及成药则取适量样品，加 70% 甲醇超声提取后处理得到。方法学考察显示，9 种成分在各自质量浓度范围内线性关系良好，精密度、稳定性、重复性实验的 RSD 均符合要求，加样回收率在 95.1%~105% 之间，表明该方法准确可靠。
通过测定 9 种指标成分在护肝片处方药材、中间体、成药中的含量，计算其在药材 - 中间体 - 成药制备过程中的转移率，以明确符合量值传递规律的潜在质量标志物。转移率计算公式为：转移率(%)=W/M×100%，其中 M、W 分别表示指标性成分转移前、后的质量。
结果显示，14 批护肝片成药中柴胡皂苷 b₂、(R,S)- 告依春、甘氨猪去氧胆酸的质量分数范围分别在 0.0088%~0.011%、0.0026%~0.0061%、0.71%~0.91%，从药材至成药的平均转移率分别为(23.4±11)%、(22.6±13)%、(59.8±8.9)%，平均转移率均大于 20%，且转移率均在均值 ±3SD 范围内，可稳定传递。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子丙素的质量分数范围分别在 0.14%~0.18%、0.042%~0.049%、0.011%~0.014%、0.023%~0.031%、0.051%~0.072%，从药材至成药的平均转移率分别为(7.7±3.1)%、(8.14±3.2)%、(5.20±2.2)%、(6.73±3.0)%、(5.77±2.0)%，转移率小于 20%。但这 5 种成分均来源于五味子，考虑到其在五味子中的占比及含量，即使转移率较低，可能通过数量优势对整体药效产生影响，故将其作为潜在的组合质量标志物，其质量分数范围为 0.22%~0.28%，从药材至成药的平均转移率为(7.39±3.0)%。绿原酸质量分数范围为 0.090%~0.14%，转移率为(2.65±1.4)%，转移率较低，不建议作为潜在质量标志物。因此，基于质量标志物 “传递性” 要求，确定柴胡皂苷 b₂、(R,S)- 告依春、五味子成分组合物(五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子丙素)、甘氨猪去氧胆酸为护肝片潜在质量标志物。
以 14 批样品中柴胡皂苷 b₂、(R,S)- 告依春、五味子成分组合物、甘氨猪去氧胆酸的峰面积为变量进行主成分分析。主成分分析得分图显示，不同批次间质量标志物含量无明显差异，表明 14 批护肝片样品质量稳定。以累计贡献率 > 80% 作为判定依据，提取到 3 个主成分，其累计方差贡献率为 89.05%，表明这 3 个主成分可以代表 89.05% 的质量标志物峰面积信息。根据各成分色谱峰面积在 3 个主成分上的载荷值，柴胡皂苷 b₂、甘氨猪去氧胆酸是对第一主成分影响较大的特征向量，主要与柴胡和猪胆粉有关;五味子成分组合物是对第二主成分影响较大的特征向量，主要与五味子有关。结合潜在质量标志物筛选结果，发现柴胡皂苷 b₂、甘氨猪去氧胆酸和五味子成分组合物是对护肝片整体质量影响较大的指标成分。
以护肝片行业治疗的常见肝病为疾病模型，建立相关网络并获得重叠靶点，根据相互作用建立蛋白质 - 蛋白质相互作用网络，选择 AKT1 和 JUN 作为候选蛋白靶点。通过表面等离子体共振技术验证关键质量标志物与这两个靶点的结合情况。
实验确定 AKT1 和 JUN 蛋白在芯片上偶联的最佳 pH 值为 4.0。检测结果显示，柴胡皂苷 b₂、甘氨猪去氧胆酸、五味子甲素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙和五味子酯甲与 AKT1 的亲和动力学参数 KD 值分别为 0.0349、3230、0.737、0.0659、0.248、441、0.474μmol・L⁻¹，与 JUN 的亲和动力学参数 KD 值分别为 0.0387、3.45、198、382、105、0.0395、0.643μmol・L⁻¹。基于 AKT1 靶点蛋白，亲和力强的指标成分包括柴胡皂苷 b₂、五味子丙素、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素，五味子醇乙、甘氨猪去氧胆酸亲和力较弱;基于 JUN 靶点蛋白，亲和力强的指标成分包括柴胡皂苷 b₂、五味子醇乙、五味子酯甲、甘氨猪去氧胆酸，五味子醇甲、五味子甲素、五味子丙素亲和力较弱。
本研究通过对护肝片9种重要指标成分的含量测定，分析其在药材 - 中间体 - 成药过程中的量值传递规律，确定了潜在质量标志物。结合主成分分析筛选出对护肝片整体质量影响较大的成分，并利用表面等离子体共振技术验证了这些成分与关键靶点蛋白的亲和力。最终发现，柴胡皂苷 b₂、甘氨猪去氧胆酸为护肝片关键质量标志物，五味子甲素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲为护肝片组合质量标志物。该研究为提升护肝片的质量标准提供了科学依据，有助于更好地控制护肝片行业的生产质量，保障其临床疗效。同时，研究也存在一定局限性，如样品选择代表性有限，未体现下游生物效应的表达情况，后续将进一步拓展研究以完善相关结果。
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