中国报告大厅网讯，生物检测试剂的扩增性能，尤其是酶试剂的生物活性，对荧光定量 PCR 等检测结果起着决定性作用。随着分子生物学与医学领域的快速发展，生物试剂的应用场景不断拓展，从实验室延伸至临床诊断、野外检测等多个领域。然而，生物试剂中如 DNA 聚合酶、逆转录酶等活性成分易受温度、湿度等环境因素影响，若保藏与运输条件不当，会导致酶失活、引物探针降解等问题，大幅降低检测成功率。当前，行业内亟待通过优化保藏技术，实现生物试剂室温下长时间稳定保藏与非冷链运输，保障检测结果的稳定性、准确性、特异性和灵敏度，这已成为推动生物试剂行业高质量发展的关键课题。以下是2025年生物试剂行业技术分析。
《2024-2029年中国生物试剂行业市场深度研究及发展前景投资可行性分析报告》指出，生物试剂主要包含引物、探针、三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA 聚合酶、逆转录酶、Mg²⁺等成分，不同成分的低温保藏要求存在差异。一般合成的引物为干粉状，从有机溶剂中干燥而来，具备无菌、无核酸酶特性，可在室温或 - 20℃密闭环境下长期保存，而溶解后的 DNA 则需保存在 - 20℃;TaqMan 探针需避光保存以防止荧光基团降解，干粉状态下可在 - 80℃保存一年以上，稀释为液体后需在 - 20℃保存，且要避免反复冻融;dNTP 由 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 四种基本核苷酸组成，是新 DNA 链的组成元件及 PCR 反应必需组分，在常见 PCR 应用中，各种 dNTP 的常用终浓度通常为 0.2 mmol・L⁻¹，一般在 - 20℃保存;DNA 聚合酶、逆转录酶等酶制剂属于生物热敏性物质，高温条件下易失活，通常需在 - 20℃保存，且液体形式的酶制剂稳定性较差，保藏周期短，其活性还会受金属离子浓度、pH 值、温度等因素影响。
在实际应用中，科学研究常用的商品化生物检测试剂盒在 - 20℃条件下可保藏 1 年左右，且大部分试剂盒会明确标注反复冻融次数。生物试剂中的逆转录酶、DNA 聚合酶等生物活性物质，必须依赖低温冰箱进行保藏。实验数据表明，当酶的储存温度为 - 20℃时，可保存 6 个月以上，而在 37℃保藏条件下，随着时间延长酶活性会不断下降。若生物试剂中的酶等成分经过较长时间的高温运输，或暴露于较高温环境中，可能导致实验结果出现假阴性等不良后果;同时，实验操作人员在保藏试剂过程中若反复冻融，也会引发较大实验误差。因此，为保证酶的活性，必须确保生物试剂在低温条件下进行保藏与运输。
鉴于低温保藏在生物试剂运输与操作方面的不便，常温保藏方法逐步发展起来。要维持 qPCR 等生物检测试剂在常温保藏和运输中的生物活性，关键在于去除试剂中的水分，减少各反应组分在保藏过程中可能发生的物理、化学变性及降解反应。目前，去除生物试剂中水分的方式主要有两种：一种是针对一般非生物活性试剂的加热干燥处理，但加热过程可能导致生物活性物质失活;另一种是真空冷冻干燥技术(简称 “冻干”)，该技术先将液态生物试剂冷冻，再将其置于密闭环境中，在近真空条件下使液态水升华成气态水，从而实现水分去除。
真空冷冻干燥技术的流程主要包括三个阶段：首先是预冻处理，将生物试剂放置在低温冰箱中，使溶液中的自由水预先冷冻到固态;其次是升华干燥，在真空条件下通过升华作用去除生物试剂中的固态水，这是冻干过程中水分去除的主要阶段，升华干燥速率会通过影响水蒸气逸出快慢，进而影响生物试剂的内部结构，升华干燥完成后仍会残留 10% 左右的水分，包括自由水和结合水;最后是解析干燥，在真空条件下通过解析作用去除升华干燥未除尽的水分，由于结合水的解析需要较高能量和推动力，此阶段设置的温度需在不影响试剂的前提下尽可能高，真空度尽可能低，解析完成后试剂中可能仍存在 1% 左右的残留水分。
该技术因全程在低温下进行，能最大程度降低对酶等热敏性生物活性物质的损害，应用范围广泛。实验数据显示，经真空冷冻干燥处理的核酸检测试剂，在 20℃密封保藏条件下，检测性能与未冻干液态检测试剂无明显差异;全预混草鱼呼肠孤病毒 Ⅱ 型一步法冻干检测试剂，4℃可保存 12 个月，室温 25℃可保存 3 个月，37℃可保存 15 天，实现了常温运输和短时间保存;分枝杆菌核酸检测试剂预混液经冻干处理后，在 4℃或 20℃保存 1 年，或在 37℃保存 3 个月，仍能保持较高活性;橡树猝死病核酸检测试剂冻干后，室温保存 20 周，活性依旧维持在较高水平。此外，真空冷冻干燥技术在生物制药领域应用广泛，大幅提升了制药效率，在疫苗研发与生产中也发挥重要作用，如改进水痘减毒活疫苗冷凝分装工艺制备稳定一致的冷凝疫苗、通过重组慢病毒载体冻干制备无需冷冻保存的病毒基因载体、研发乳头状瘤病毒冻干粉末疫苗，且该疫苗能实现与市面上人乳头状瘤病毒疫苗相同的免疫原性，可常温储存和运输。
不过，真空冷冻干燥技术也存在不足：生物试剂冻干过程中可能出现扩增性能下降，主要因酶试剂在冻干过程中失活，需添加海藻糖、蔗糖或葡聚糖等冻干保护剂维持生物活性，且保护剂的筛选与验证对冻干试剂检测性能至关重要;试剂脱水后有效物质残留少，呈粉末状，转移困难，冻干过程中可能需添加聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇或山梨醇等赋形剂，而赋形剂对预混装试剂检测性能的影响仍需进一步验证。
喷雾干燥技术的原理是通过雾化器将液体分散为细小颗粒，雾滴在干燥热介质空间中蒸发水分，最终得到干粉物质，主要分为三个步骤：一是雾化，利用雾化器将液料雾化形成微小雾滴;二是干燥，雾滴与热空气直接接触，迅速蒸发干燥;三是分离，对干燥颗粒进行分离和收集。目前常用的雾化器主要有压力式喷雾器、气流式喷雾器、离心式喷雾器等类型。
喷雾干燥技术具有显著特点：雾化后雾滴体积大幅增大，与高温空气接触瞬间可实现 90%~95% 以上的水分蒸发，根据设备差异，干燥时间可在 5~30 秒内，能实现物料迅速干燥且不受高温影响;针对热敏性物料，在喷雾干燥时，物料与热空气直接接触，但多数热量用于蒸发水分，物料温度不会超过高温空气湿球温度，也不会受高温空气影响，能保证质量品质;适用于从高级合成物到化学品的生产，可处理料液固含量在 0~60% 的含固物料干燥过程，通过调整工艺参数，能高效生产出满足粉末颗粒大小、形状、密度、分散性、多态性及流动性等精准特性的高质量粉末。
当前，生化医疗领域产品加工行业常用的真空冷冻干燥法可能导致生物材料孔层塌陷，影响其理化结构，而喷雾干燥法可避免这一问题。但现有喷雾干燥技术的干燥温度会对生物试剂活性产生影响，高温喷雾法及亚高温喷雾法温度均大于 60℃，常温喷雾法进口温度为 0~60℃，且常温喷雾法存在干燥动力小、除湿难度大的问题。因此，在生物试剂保藏方面，喷雾干燥技术可结合冷冻干燥，降低干燥试剂的能耗。除传统喷雾干燥技术外，近年来针对不同领域还出现了节能喷雾、冷冻喷雾、纳米喷雾和过热蒸汽喷雾等新型喷雾干燥技术。其中，喷雾冷冻干燥技术是近年发展的微粉化新技术，结合了真空冷冻干燥技术和喷雾干燥技术的优势，适用于蛋白质和肽类等性质不稳定成分的微粉化处理，能缩短冷冻和干燥时间，获得孔隙率高、生物活性高的粉末产品，在食品、医药等领域应用广泛。例如，利用该技术生产全脂奶粉，可有效缩短干燥时间，获得高孔结构奶粉粉体;制备的鱼油微胶囊颗粒粒径集中分布在 117.13~200.06μm，与传统喷雾干燥制备的鱼油微胶囊产品相比，质量更优。
在医药领域，喷雾冷冻干燥技术常被应用于药物研究，如研制治疗骨质疏松症的激素类药物鲑鱼降钙素;通过优化喷雾干燥工艺制备柚苷酶固体酶制剂，所得酶制剂中鼠李糖苷酶活力达 19000 U・g⁻¹，酶活总回收率为 78.1%，柚苷酶活力达 4700 U・g⁻¹，酶制剂含水量 6.5%;利用喷雾干燥技术制备固态植酸酶制剂，植酸酶的酶活回收率可达 80%。喷雾干燥技术已成为酶制剂干燥领域应用最广泛的技术之一，采用喷雾冷冻干燥技术可生产出生物活性高、可溶性好、粒径可控的多种产品，在医药领域应用前景广阔。但该技术也存在不足，主要包括能耗高、设备昂贵且体积大、结构复杂、操作不灵活、易粘壁等，后续还需开展该技术对 DNA 聚合酶和逆转录酶生物活性影响的研究，为生物试剂保藏提供更多思路。
目前，疫苗、免疫血清、免疫球蛋白、抗原及生物酶等生物制品多以溶液形式生产，这些生物试剂在常温条件下极易发生蛋白质快速降解，导致生物活性大幅降低。真空冷冻干燥技术的冻干过程中，试剂需承受多种应力，这些应力常直接或间接导致蛋白质活性不稳定，而玻璃化冷冻技术为解决这一问题提供了新途径。
玻璃化冷冻技术中的玻璃化，是指在一定降温速率下，液态物质直接转变为玻璃化固体状态的过程，此过程中不会生成晶体结构，还能保持液相时期分子及离子的分布，且在冷冻和解冻过程中不会在液态和晶体之间来回变化，其力学性质与玻璃相似，故称为玻璃态，这是一种介于液态与固态之间的状态。发生玻璃化转变时对应的温度称为玻璃化转变温度(Tg)，要保持制品的玻璃态，需将其储存在低于或等于该物质 Tg 的环境中，若制品的 Tg 高于室温，则有望实现室温下较长时间的稳定保存。
在蛋白质生物药物领域，利用玻璃化冷冻技术可延长药品贮存时间，实现非冷链条件下的稳定保藏。例如，加入海藻糖等保护剂，采用玻璃化冷冻技术生产的疫苗，能在极端温度下保藏;使用海藻糖等冻干保护剂、蛋氨酸和明胶等，通过玻璃化冷冻技术研制的热稳定减毒活沙门氏菌 Ty21a 细菌疫苗，在 37℃条件下可稳定储存约 12 周，该技术不仅提高了活 Ty21a 疫苗的温度稳定性，还增强了产品的免疫原性，有效延长了疫苗保质期，实现了疫苗常温储存和运输，为不发达地区使用疫苗提供了极大便利。
在生物试剂保藏方面，生物酶通常是与甘油按一定比例混合后在低温条件下保藏，应用玻璃化冷冻技术可改善酶试剂的保藏条件。实验数据显示，使用 Ficoll400 和松三糖等试剂研制的玻璃化限制性内切酶，可在室温或 37℃条件下稳定保藏 4 个月;研制的克隆小鼠白血病病毒逆转录酶与 Klenow 酶，可在室温条件下保藏，且能在 30 秒内复溶于水，研究表明其 Tg 至少为 40℃(45℃为最佳)，才能保证制品在室温下的稳定性;以海藻糖作为保护剂，利用玻璃化冷冻技术研制的乳酸盐脱氢酶，可在 60℃条件下稳定保藏 4 周。
玻璃化冷冻技术在玻璃化期间也需添加海藻糖等冻干保护剂，以防止酶结构剧烈变化，维持生物制品高活性，延长稳定保藏时间，降低冷链保藏及运输的经济成本。该技术目前在细胞与胚胎、组织和器官中的应用也较多，例如对人体大型卵巢组织进行玻璃化冷冻，经形态学分析、凋亡检测及免疫组织化学方法检测解冻后的卵泡活性发现，玻璃化组与程序冷冻组在解冻后原始卵泡比例、正常形态及卵泡凋亡率方面无统计学差异，且玻璃化组间质细胞凋亡率低于程序冷冻组。玻璃化冷冻技术具有操作步骤简便、储存稳定性好、复苏率高等优势，此外，在低毒性保护剂浓度和较高降温速度的前提下优化玻璃化制品的 Tg，即可实现制品常温储存，这对该技术的进一步发展和应用具有重要意义。
目前，大部分生物试剂行业仍需依赖专门的冷链运输，相关设备复杂、成本高昂、运输耗时，对于交通落后地区，难以实现空运。若遭遇重大紧急疫情爆发，很可能因冷链运输资源紧张、运输费时或疫区交通不便，导致试剂供应不及时。冷冻保藏作为一项重要手段，在生物、医学领域对生物试剂、细胞或组织等的保藏中仍发挥着重要作用。因此，选择合适的保藏技术手段，对于生物试剂的运输、维持活性物质的生物活性、保证检测质量及稳定性具有重要意义。
随着分子生物学检测技术应用日益广泛，生物试剂保藏问题备受关注，真空冷冻干燥技术、喷雾冷冻干燥技术和玻璃化冷冻技术等保藏技术应运而生，实现了生物试剂的常温稳定保存，解决了生物试剂低温储存和运输的限制。但冷冻干燥过程中，冷冻阶段、干燥阶段以及冻干后的试剂保藏过程相对复杂，其中冷冻阶段冰 - 水界面形成、速冻等均可能导致蛋白质变性 / 降解反应增加，不可避免地对生物试剂中部分生物活性物质造成损伤;此外，干燥阶段可能导致酶等蛋白质周围水分去除后，天然构象发生变化，进而影响其生物活性。
生物试剂中的 DNA 聚合酶可耐高温，具有高度热稳定性，冻干后稳定性较易维持;而逆转录酶不耐受高温、稳定性较差，冻干后维持长期保藏的难度较大。同时，生物试剂中的引物、探针为寡核苷酸片段，保藏不当会导致其降解。目前，引物 / 探针冻干粉形式的生产工艺已相对成熟，广泛应用于实验室科研和临床诊断中，大部分商品化的核酸提取试剂盒(磁珠法)中也使用了可常温保藏冻干粉形式的蛋白酶 K，避免了酶在长时间的高温运输或者由于操作 / 保藏不当暴露于较高温度环境下，可能造成实验结果出现假阴性等不良后果。
商品化的 DNA 聚合酶 / 逆转录酶一般需要添加甘油后在 - 20℃低温保藏，运输过程依赖冷链运输。目前，核酸检测试剂多数为酶混合液与核酸扩增反应液分开包装，部分商品化试剂盒以一管式预混液形式存在，但均为液体形式，无法实现常温保藏及运输。而且在 - 20℃低温保藏条件下，除酶以外多为冷冻固态，实验过程中需解冻，且试剂的配制较为复杂繁琐，实验人员操作不当极易引起试剂漏加、交叉污染等情况，因此正规的核酸检测实验室会设置分区，由专业人员进行实验操作。此外，各反应组分尤其是引物、探针和酶用量较少，对移液器的精准度要求高，且试剂配制完成后需将其混匀或借助离心机回收吸附在管壁上的液体。
目前，尽管有一些商品化的生物试剂以混合形式存储在一个反应管中，称为 “预混装”，以简化操作，但这种储存方式并非每个反应组分的最佳储存环境，其性能和稳定性也会受到一定程度的影响。例如，保存在 “预混装” 试剂中的酶可能会因失去甘油的保护而变性失活或降解;引物和探针可能会因稀释而导致在储存过程中降解速度高于原本高浓度的 “母液” 形式;此外，“预混装” 中包含了除核酸模板以外 qPCR 所需的全部成分，可能会引起无模板情况下的非特异性扩增反应。为最大程度地维持酶的生物活性，备选方法是将 PCR 试剂与酶分开储存，使用 “半预混装” 的方式，但除酶以外的 PCR 试剂并不能在最优条件下保存，其活性仍然受到一定程度的影响。在操作过程中，虽然试剂添加步骤相对减少，但操作者仍需将酶与 “半预混装” 试剂混合在一起，且酶的用量非常少，因此仍需依赖精确的移液器进行操作，同时混合之后仍需混匀处理。由此可知，当前生物试剂的保藏技术大部分为低温储藏，在低温保藏条件下，液态生物试剂实验过程中需要考虑人员的专业性和严谨性，且操作步骤较为复杂，一定程度上限制了核酸检测技术的发展以及在非实验室检测环境开展检测活动。
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